Con il costante miglioramento dell’efficienza dei metodi di somministrazione non virale, c’è il potenziale per accelerare e rendere più conveniente lo sviluppo di terapie cellulari e geniche, al tempo stesso riducendo gli effetti avversi.
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La consegna non virale promette una vera alternativa per gli sviluppatori di terapie cellulari
Man mano che l’efficienza dei metodi di somministrazione non virale migliora, essi hanno il potenziale per rendere lo sviluppo di terapie cellulari e geniche più rapido ed economico, oltre a mitigare gli effetti avversi.
L’elevato costo delle terapie cellulari a base virale ha spinto alcuni ricercatori a concentrarsi su CRISPR-Cas9 utilizzando metodi di somministrazione non virali. Credito: Natali _Mis/Shutterstock
Le terapie con cellule CAR-T stanno rivoluzionando il trattamento dei tumori del sangue e il loro pieno potenziale è ancora in fase di studio in centinaia di studi clinici. In questa terapia, le cellule T di un paziente vengono geneticamente modificate ex vivo in modo che esprimano un recettore dell’antigene chimerico (CAR) che prende di mira un antigene sulle cellule tumorali. La maggior parte delle terapie CAR-T attualmente approvate utilizzano un sistema di rilascio di vettori virali per introdurre il CAR nelle cellule T. Tuttavia, la consegna virale presenta alcuni inconvenienti, come l’incapacità di regolare il dosaggio o una risposta immunitaria indesiderata.
Un altro problema è il costo elevato dello sviluppo di nuove terapie. “I retrovirus di livello clinico che è possibile utilizzare negli studi clinici in fase iniziale presso i centri di ricerca accademici sono estremamente costosi”, afferma Dimitrios Wagner, capo della ricerca e sviluppo presso il Centro per le terapie avanzate di Berlino presso Charité – Universitätsmedizin Berlin.
La procedura di controllo qualità per questi vettori è estremamente rigorosa perché verranno utilizzati in terapia. Se un vettore virale non raggiunge i risultati desiderati, può ritardare lo sviluppo di oltre un anno. “Finirai per pagare milioni”, afferma Wagner, “e questo non include la sperimentazione clinica che devi ancora condurre”.
Tuttavia, la maggior parte delle attuali terapie CAR-T si basano ancora su meccanismi di rilascio virale. Uno dei motivi è l’elevata efficienza della diffusione virale, che i metodi non virali tradizionalmente faticano a eguagliare. Ma il recente lavoro per ottimizzare l’efficienza dell’editing non virale sta iniziando a cambiare il quadro, evidenziando i vantaggi dei sistemi di editing CRISPR non virale come veicolo di consegna alternativo per la prossima ondata di terapie cellulari e geniche.
Vantaggi non virali
Considerati i costi associati alle terapie cellulari a base virale – che in genere vanno da 400.000 a 1 milione di dollari per paziente 1 – Wagner e altri ricercatori si sono concentrati su CRISPR-Cas9 utilizzando metodi di somministrazione non virali. “La nostra motivazione era rendere l’ingegneria cellulare più economica rendendola non virale”, afferma Wagner.
Oltre al costo inferiore, ciò consente anche di inserire il CAR in una posizione mirata, come la catena alfa del recettore delle cellule T. “In questo modo”, afferma Wagner, “abbiamo scoperto che possiamo generare cellule CAR T che sono altrettanto buone di quelle trasdotte con lentivirus”.
Un modo per ottenere una trasduzione non virale è utilizzare l’elettroporazione per introdurre DNA a filamento singolo (ssDNA) o DNA a doppio filamento (dsDNA) nella cellula. Le cellule CAR T prodotte con tali metodi di somministrazione non virale sono altrettanto capaci di colpire gli antigeni sulle cellule tumorali, ma non presentano gli stessi rischi ed effetti collaterali associati alla somministrazione virale 2 . Ad esempio, la consegna virale può portare a un’espressione eccessiva di CAR, che esaurisce o addirittura uccide la cellula nel tempo.
Un altro vantaggio della consegna non virale è che è molto più veloce. “Può volerci molto tempo per procurarsi un plasmide per un vettore virale”, afferma John Zuris, direttore delle tecnologie di editing presso Editas Medicine. “Quelli non sono plasmidi banali da realizzare. Spesso hanno componenti e sequenze altamente ripetitive”.
Superare il deficit di efficienza
Quando si utilizzano lentivirus o retrovirus per inserire CAR nelle cellule T, quasi tutte le cellule assorbono il vettore virale. I metodi di somministrazione non virali sono stati molto meno efficienti, nell’ordine del 20-40%. Questi numeri hanno reso difficile l’affermazione dei metodi di consegna non virali.
“È fondamentale raggiungere l’efficienza dei vettori virali che stiamo vedendo”, afferma Zuris. Ha lavorato a una soluzione per superare la bassa efficienza della consegna non virale. Questo sistema, chiamato SLEEK (SeLection by Essential-gene Exon Knock-in), seleziona le cellule che hanno assorbito con successo il loro carico knock-in, aumentando l’efficienza fino al 90% circa 3 .
Avere un modo per arricchire solo quelle cellule che ne hanno preso il carico riduce anche al minimo la necessità di sovraccaricare le cellule con troppo DNA modello, il che riduce il rischio di effetti collaterali tossici innescati dalla presenza di frammenti di DNA estranei nella cellula.
Wagner ha utilizzato anche SLEEK in alcuni dei suoi esperimenti. “È un sistema molto carino”, afferma. “Vediamo molte opportunità per adottarlo, soprattutto per l’ingegneria multiplex”.
Ma l’arricchimento da solo non è la soluzione magica per far funzionare la diffusione non virale. “Una delle cose che abbiamo scoperto sperimentalmente è che sono necessari reagenti di altissima qualità”, afferma Zuris.
Gli elementi costitutivi della consegna non virale
Lumeng Ye, scienziato senior presso GenScript, ha lavorato su reagenti per la somministrazione non virale negli ultimi cinque anni. “All’epoca, c’era un crescente interesse nell’utilizzo di questa applicazione per l’editing genetico CRISPR”, afferma. “Abbiamo iniziato a cercare payload di DNA non virale e modi per rendere l’editing più preciso e sicuro”.
I sistemi di distribuzione non virali possono rendere il processo di modifica delle cellule molto più semplice, afferma Ye. “Invece di due o tre passaggi, possiamo eseguire il knock-out o il knock-in in un solo passaggio.”
GenScript ora offre diverse soluzioni per la consegna non virale, come il DNA a filamento singolo. Wagner, che ha utilizzato l’ssDNA di GenScript, sottolinea che questo tipo di sistema di somministrazione è molto meno tossico per le cellule rispetto al dsDNA, rendendo possibile l’aggiunta di dosi più elevate e l’aumento dei tassi di knock-in.
Il panorama della diffusione non virale è cambiato rapidamente in pochi anni. “Ci siamo spesso chiesti se la somministrazione non virale potesse essere efficiente quanto l’approccio virale”, afferma Ye, “ma i ricercatori di diversi laboratori hanno continuato a ottimizzare il processo o la progettazione per renderlo più efficiente”.
Mentre alcuni anni fa, la dimensione di un inserto di DNA era uno dei fattori limitanti per la consegna non virale, strategie di ottimizzazione come SLEEK hanno aperto la strada per rendere più efficiente anche la consegna di carichi più grandi. Nel frattempo, anche le apparecchiature per l’elettroporazione stanno diventando più efficienti e meno dannose per le cellule. “È come se tutti stessero lavorando insieme su diversi sforzi per realizzarlo”, afferma Ye.
Wagner ritiene inoltre che sia giunto il momento per la diffusione non virale. “Una volta che avremo alcune prove cruciali che dimostreranno che, ad esempio, un prodotto CAR-T-cell può essere molto efficiente quando è fabbricato in questo modo, allora sempre più persone adotteranno queste tecnologie”, afferma.
E con la consegna non virale che porta vantaggi in termini di velocità ed efficienza in termini di costi, Zuris pensa che presto prenderà piede su larga scala: “Solo la capacità di bypassare la produzione di vettori virali sarebbe così importante”.
Redazione NurseNews.eu
Fonte Nature